金黄色葡萄球菌

2018-01-16

金黄色葡萄球菌定量检测

一、实验前期准备

确定参数：金黄色葡萄球菌
确定检测方法：GB4789.10-2016第二法
确认实验方案：把所涉及的试剂进行排查，查询是否缺某种试剂；梳理实验思路，整理实验流程，便于记录实验结果。
配置所需培养基：无菌水、BP琼脂平板、血平板、革兰氏染色液脑心浸出液肉汤BHI、冻干兔血浆等

二、实验操作

1.阅读说明书，水化冻干粉（如下图）

阅读说明书

水化冻干粉
备注：
水化时建议提前准备无菌三角瓶或者无菌袋，分四次水化安培瓶，每次5ml(4＆5ml)。最后收集共40ml混匀备用。

开取西林瓶时，注意安全，以及观察盲样状态是否完好。

2.实验步骤
- 2.1 样品接种
  
  根据对金葡盲样的评估，尽量选择稀释度范围较大一些，尽量使同一稀释度三个平板菌落数在20-200CFU之间（这里我们选择100-106）。每个稀释度吸取1ml匀液以0.3ml、0.35ml、0.35ml接种于BP琼脂平板，36℃培养24-48h。
  
  备注：新配制的BP琼脂平板有水珠，应放置生物安全柜吹干或者放置培养箱烘干，计数时菌落不会蔓延。涂布时用一次性塑料涂布棒，注意不要触及平板边缘。计数时菌落清晰好计数。涂布后，静置10min，待样液完全吸收后再倒置培养。
- 2.2 典型菌落计数
  
  金葡标准菌株在BP琼脂平板上的形态：黑色，其周围有浑浊带，其外层有一透明圈。对比如下图：
  
  BP琼脂平板：黑色，其周围有浑浊带，其外层有一透明圈。如下图：
  
  选择有典型菌落的平板，且同一稀释度3个平板菌落数之和在20-200CFU之间，计数如下：
  
  备注：表格中黑色数据为典型菌落（黑色，其周围有浑浊带，其外层有一透明圈），红色数据为黑色，无浑浊带，无透明圈。
- 2.3 典型菌落确认
  
  同一稀释度3个平板菌落数之和在20-200CFU之间的稀释度是103，从典型菌落中选取5个可疑菌落进行鉴定（按照1:2:2挑取可疑菌落）。
  - 2.3.1镜检
    
    金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状。
  - 2.3.2 溶血现象
    
    典型菌落接种于血平板36℃培养24h，菌落周围有溶血圈。如下图：
  - 2.3.3血浆凝固酶实验
    挑取5个可疑菌落分别接种于5ml脑心浸出液肉汤BHI中，36℃培养18-24h。如下图（培养后）：
    
    备注：为了避免接种环未将可疑菌落接种到BHI中増菌，这里我们用一次性棉拭子进行接种培养。
    
    再吸取0.2-0.3mlBHI待测液接种冻干兔血浆中，观察6 h，每半小时观察一次。如下图：
    
    冻干兔血浆凝固如下图：
    
    5个可疑菌落均凝固，为阳性结果。